Nach ihrem endgültigen Sieg über den bösen Schredder haben sich die vier Ninja-Kampfschildkröten mit ihrem Meister Splinter (James Murray) abermals in der heimischen New Yorker Metro zurückgezogen. Dort trainieren sie tagein, tagaus ihre Kampfsportübungen und gehen vor Langerweile beinahe zugrunde.
Einst ließ eine grell-grün leuchtende Substanz vier Schildkröten zu menschenähnlichen Kampfmaschinen mutieren. Unter der Leitung ihres Meisters, der Ratte Splinter (Kevin Clash), haben sich Leonardo (Mark Caso), Michelangelo (Michelan Sisti), Donatello (Leif Tilden) und Raphael (Kenn Scott) dem